Molecular Neurodegeneration volumen 17, Número de artículo: 30 (2022) Citar este artículoLa captación neuronal y la posterior propagación de semillas proteopáticas, como αS (alfa-sinucleína), Tau y TDP-43, contribuyen a la neurodegeneración.La maquinaria celular que participa en este proceso es poco conocida.Una proteinopatía llamada proteinopatía multisistémica (MSP) está asociada con mutaciones dominantes en la proteína que contiene valosina (VCP).Los pacientes con MSP tienen degeneración muscular y neuronal caracterizada por patología agregada que puede incluir αS, Tau y TDP-43.Realizamos una pantalla CRISPR-Cas9 de todo el genoma basada en la clasificación de células fluorescentes en biosensores αS.La actividad de siembra de αS y TDP-43 en diversas condiciones se evaluó utilizando células biosensoras FRET/Flow o inmunofluorescencia para αS o TDP-43 fosforilados en neuronas cultivadas primarias.Analizamos la actividad de siembra in vivo mediante inmunotinción para αS fosforilada después de la inyección intraestriatal de semillas de αS en ratones control o portadores de mutación de la enfermedad de VCP.Se identificaron ciento cincuenta y cuatro genes como supresores de la siembra de αS.Un supresor, VCP, cuando se inhibió química o genéticamente aumentó la siembra de αS en células y neuronas.Esto no se debió a un aumento en la captación de αS o los niveles de proteína αS.La expresión de la mutación MSP-VCP aumentó la siembra de αS en células y neuronas.La inyección intraestriatal de fibrillas preformadas de αS (PFF) en ratones portadores de la mutación VCP-MSP aumentó la expresión de fosfoαS en comparación con los ratones de control.Las células que expresan de forma estable los pares FRET del fragmento C-terminal de TDP-43 marcados con fluorescencia (biosensores TDP-43) generan FRET cuando se siembran con TDP-43 PFF pero no con TDP-43 monomérico.La inhibición de VCP o la expresión mutante de MSP-VCP aumenta la siembra de TDP-43 en biosensores de TDP-43.De manera similar, el tratamiento de neuronas con TDP-43 PFF genera TDP-43 fosforilado insoluble de alto peso molecular después de 5 días.Este aumento dependiente de semilla de TDP-43 en TDP-43 fosforilado se aumenta aún más en neuronas que expresan mutantes de MSP-VCP.Usando una pantalla imparcial, identificamos el AAA ATPase VCP multifuncional como un supresor de la siembra de agregados αS y TDP-43 en células y neuronas.VCP facilita la limpieza de los lisosomas dañados a través de la lisofagia.Proponemos que la vigilancia de VCP de los endosomas permeabilizados puede proteger contra la propagación proteopática de los agregados de proteínas patógenas.La propagación de distintas especies agregadas puede dictar los fenotipos pleiotrópicos y las patologías en la MSP asociada a VCP.La α-sinucleína (αS) es el componente principal de las inclusiones de proteínas que se encuentran en una familia de trastornos neurodegenerativos conocidos como sinucleinopatías [1].Las sinucleinopatías incluyen la enfermedad de Parkinson, la enfermedad difusa de cuerpos de Lewy (DLB), la atrofia multisistémica y el trastorno de conducta del sueño REM (RBD) [1].αS contiene una región de tipo amiloide que la hace propensa a acumularse.Varias líneas de evidencia sugieren que la αS agregada puede sembrar la fibrilación de la αS monomérica soluble [2].Este proceso puede estar relacionado con la patogenia y la progresión de la enfermedad [3].Las fibrillas αS ingresan a las neuronas a través de la endocitosis y moldean nuevos agregados αS dentro del citoplasma [4].Esto conduce a la pérdida de sinapsis, la neurodegeneración y, en última instancia, la liberación de fibrillas αS a las células adyacentes, lo que da como resultado una propagación agregada a lo largo de las neuronas interconectadas [3].El proceso celular de siembra proteopática consta de varios pasos regulados.Estos incluyen la captación de semillas, el tráfico vesicular, el escape endolisosomal y la conversión moldeada de αS citosólica [5].Una ruta de captación de semillas es la endocitosis.Las semillas de αS pueden entrar en las células y las neuronas a través del sistema endocítico.Estas semillas luego penetran la membrana endolisosomal facilitando su escape hacia el citoplasma [5].El bloqueo farmacológico de la captación celular o el aumento del daño de la membrana endolisosomal pueden disminuir y aumentar la eficiencia de siembra, respectivamente [5].Estudios previos han identificado modificadores genéticos de la toxicidad de αS asociados con su expresión intracelular en levaduras o C. elegans [6].Sin embargo, no se han explorado los modificadores genéticos de la siembra proteopática.VCP (también llamado p97, o cdc48 en levadura) es una AAA-ATPasa dirigida por ubiquitina implicada en múltiples formas de neurodegeneración [7].Las mutaciones predominantemente heredadas en VCP causan proteinopatía multisistémica (MSP), asociada con múltiples fenotipos de penetración variable que incluyen miopatía por cuerpos de inclusión, demencia frontotemporal, ELA y parkinsonismo [7].Así como los fenotipos son variables, los pacientes con PCV desarrollan diversas patologías agregadas que incluyen inclusiones de αS, TDP-43, Tau, SQSTM1 y ubiquitina [8,9,10,11].No está claro cómo las mutaciones de la enfermedad de VCP conducen a la degeneración celular y las inclusiones de proteínas.VCP afecta el tráfico y la eliminación de agregados de poliglutamina in vitro [12].La VCP también es necesaria para la degradación autofágica y proteasómica de las proteínas ubiquitiladas, incluidas las proteínas asociadas a TDP-43 y ER a través de ERAD [7].Más recientemente, se ha propuesto que VCP se comporta como una proteína desagregada que actúa específicamente sobre los agregados patológicos de tau [11].Al unirse a distintos adaptadores, VCP altera su funcionalidad, lo que le permite participar en muchas otras funciones, como ERAD, tráfico vesicular, reparación de ADN y regulación del ciclo celular [7].Las mutaciones de la enfermedad de VCP alteran su asociación con distintos adaptadores [13, 14].Específicamente, las mutaciones de la enfermedad VCP han reducido la unión a UBXD1 y han aumentado las interacciones con Ufd1/Npl4 creando tanto una pérdida como una ganancia de función con respecto a los procesos dependientes de UBXD1 y Ufd1 [13,14,15,16].En particular, un complejo dependiente de VCP-UBXD1 se recluta en los endolisosomas dañados [15].Este complejo recluta la deubiquitinasa YOD1, que escinde las cadenas de ubiquitina unidas a K48 de la membrana lisosomal, lo que facilita la degradación lisofágica [15].La inhibición de VCP, la pérdida de UBXD1 o la expresión mutante de la enfermedad de VCP conducen a un retraso en la eliminación de los endosomas tardíos dañados, lo que da como resultado la acumulación de puntos puncta positivos para galectina-3 tanto en modelos de ratón VCP como en tejido del paciente [15, 17].Los pacientes con MSP se caracterizan patológicamente como una proteinopatía TDP-43 [18].El tejido del paciente con MSP acumula TDP-43 agregado e insoluble en el músculo afectado y el tejido del SNC [18].El 90 % de los pacientes con MSP tienen una miopatía que precede a la demencia en ~ 10 años [19].Se desconoce si la patología del agregado TDP-43 se propaga del músculo a la neurona motora y, en última instancia, a la corteza.TDP-43 contiene un dominio intrínsecamente desordenado o similar a un prión que facilita su conversión agregada moldeada [20].Al igual que αS, los agregados de TDP-43 pueden servir como semillas proteopáticas que se propagan en modelos de células y ratones [21, 22].Las pantallas genómicas funcionales son una herramienta poderosa para identificar proteínas que participan en distintas vías celulares.En este estudio, utilizamos un biosensor FRET de siembra αS para examinar una biblioteca de eliminación de CRISPR.Este enfoque identificó múltiples supresores de la siembra de αS, de los cuales la AAA ATPasa, VCP, se exploró más a fondo tanto in vitro como in vivo.Por lo general, HEK 293T αS-CFP/YFP se coloca en una placa de 96 pocillos de fondo negro con una densidad de 80 k/pocillo en medio DMEM con FBS al 10 % y penicilina-estreptomicina.Tres líneas celulares de control: células HEK 293T no transfectadas, células transducidas con αS-CFP y αS-YFP se cultivan en las mismas condiciones.αS PFF se somete a ultrasonidos y se prepara con OPTI-MEM y 1 μl de lipofectamina 2000 (Invitrogen) para cada pocillo y se añade gota a gota a la célula después de 48 h.Las células se recolectan después de 24 h para citometría de flujo, lo mismo que se informó.Brevemente, las células se separan con tripsina-EDTA al 0,05 % (Gibco), se centrifugan, luego se fijan con PFA al 2 % durante 15 min y finalmente se resuspenden en MACSima Running Buffer.Las muestras son analizadas por MACSQuant® VYB.La señal FRET es excitada por láseres de 405 nm y detectada por un filtro de paso de banda 525/50.Al mismo tiempo, la CFP y la YFP son excitadas por láseres de 405 nm y 488 nm y filtradas por 450/50 nm y 525/50 nm, respectivamente.Los datos se analizan con el software FlowJ v10.Cada señal de FRET se calcula como el porcentaje de la intensidad de fluorescencia media de FRET de temporización de células positivas para FRET y luego se normaliza a su control de vehículo.Los vectores VCP mcherry son un regalo del laboratorio de Hemmo Meyer.Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de Sanger (GENEWIZ) con cebadores de plásmidos VCP descritos anteriormente.Se transfectan 250 ng del plásmido con OPTIMEM y 0,5 μL de Fugene 6 (Promega) en cada pocillo 24 h después de la siembra.A continuación, las células se trataron de la misma manera que se ha descrito anteriormente.La señal de mcherry se excita con un láser de 561 nm y se filtra a través de 615/20 nm, y la señal FRET se analiza por separado para las células positivas y negativas de mcherry.El derribo se logra mediante la transfección inversa de siRNA humano SMARTPOOL de Dharmacon o Thermo Silencer Select siRNA.Se preparan 6 pmol de siRNA en OPTI-MEM y 0,3 μL de Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen) según su protocolo y se añaden a cada pocillo en una placa de 96 pocillos.A continuación, se sembraron 80 k de células αS-CFP/YFP suspendidas en cada pocillo con gotitas de siRNA.El αS PFF se trata 48 h después de la siembra como se describe anteriormente.La concentración y la duración de los tratamientos farmacológicos se resumieron en la Tabla 1 complementaria.Los plásmidos biosensores TDP-43 se diseñaron para expresar la región propensa a la agregación rica en glicina de TDP-43 de los aminoácidos 262 a 414. La expresión génica fue impulsada por un promotor CMV en un plásmido lentiviral FM5 (1).En el extremo N, se agregó un codón de alanina (GCG) para mejorar la expresión, y el extremo C se fusionó con un enlazador flexible de 12 aminoácidos (GGTTCTGCTGGCTCCGCTGCTGGATCCGGCGAATTC) con mClover3 o mRuby3.El lentivirus se generó como se describió anteriormente (1) y se transdujo a células HEK293T para expresar de manera estable tanto TDP-43 aa262-414-mClover3 como TDP-43 aa262-414 mRuby3.Las líneas de células monoclonales de alta expresión se clasificaron y probaron para determinar la capacidad de respuesta a los agregados de TDP-43 de los péptidos de TDP-43 y los homogeneizados de cerebro de casos humanos con patología de TDP-43.Por lo general, HEK 293T TDP-43-Ruby/Clover se coloca en una placa de 96 pocillos de fondo negro con una densidad de 80 k/pocillo en medio DMEM con FBS al 10 % y penicilina-estreptomicina.Tres líneas celulares de control: células HEK 293T no transfectadas, células transducidas TDP-43 Ruby y TDP-43 Clover se cultivan en las mismas condiciones.TDP-43 PFF se somete a ultrasonidos y se prepara con OPTI-MEM y 1 μl de lipofectamina 20.000 (Invitrogen) para cada pocillo y se añade gota a gota a la célula después de 24 h.Las células se recolectan después de 48 h para citometría de flujo, lo mismo que se informó.Brevemente, las células se separan con tripsina-EDTA al 0,05 % (Gibco), se centrifugan, luego se fijan con PFA al 2 % durante 15 min en la oscuridad y finalmente se resuspenden en MACSima Running Buffer.Las muestras son analizadas por MACSQuant® VYB.La señal FRET es excitada por láseres de 488 nm y detectada por un filtro de paso de banda 614/50.Al mismo tiempo, Clover y Ruby son excitados por láseres de 488 nm y 561 nm y filtrados por 525/50 nm y 615/20 nm, respectivamente.Los datos se analizan con el software FlowJ v10.Cada señal de FRET se calcula como un porcentaje de la intensidad de fluorescencia media de FRET de temporización de células positivas para FRET y luego se normaliza a su control de vehículo.Las células αS-CFP/YFP HEK293T se transdujeron primero con WT Cas9-blast.Se clasificaron y cultivaron clones individuales.La nueva línea cas9 αS CFP/YFP mantuvo tanto αS-CFP como αS-YFP y fue capaz de sembrar.Las funciones Cas9 fueron validadas por un ARNg sintético y obtenidas con un 99 % de actividad NHEJ.Aproximadamente 50 millones de células HEK293T syn CFP/YFP Cas9-blast se colocaron en placas y luego se infectaron con lentivirus combinados con la biblioteca de ARNg de Brunello (Addgene #73178-LV) con 8 μg/ml de polibreno (MOI = 0,3) al día siguiente.Después de 24 h, las células se someterían a una selección de puromicina de 1 μg/ml.Las células seleccionadas se volvieron a colocar en placa a una densidad de 6, 4 x 10 ^ 5 células/ml después de 96 h de selección y se reemplazaron con puromicina fresca.2 días después, coseche 1/5 de la célula (~ 20 millones) (grupo no tratado, para la representación de la biblioteca) y sembró el resto con αS-PFF 10 nM.Las células sembradas se recogieron del mismo modo que en el ensayo αS FRET normal como se describió anteriormente después de 24 h y se clasificaron con el clasificador de células Sony SY3200.La extracción de ADN se realizó a través de QIAamp DNA Blood Midi en células FRET positivas y negativas, así como en células sin clasificar, que se amplificaron por separado mediante PCR y se secuenciaron en profundidad mediante Illumina NovaSeq.Los grupos positivos y negativos de FRET se compararon con el grupo de población total no tratado por separado a través de Megack RRA.Para el enriquecimiento de la vía, se ingresaron 154 aciertos en g:profiler y se trazaron a través de Cytoscape como se describió anteriormente.αS PFF y monómero se generan como se describe anteriormente [23, 24].Brevemente, se incubó monómero αS WT recombinante humano purificado (2 mg/ml) en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM durante 72 h a 37 °C con agitación a 1000 rpm en un Eppendorf Thermomixer.Para determinar la concentración de fibrillas, la mezcla de reacción de fibrillas se centrifugó a 18.000 xg durante 15 min para separar las fibrillas del monómero.La concentración de monómero αS en el sobrenadante se determinó en un ensayo de proteína BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando la curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA).La disminución medida en la concentración de monómero αS se usó para determinar la concentración de fibrillas en la mezcla de reacción de fibrillas de 72 h.Para aislar las fibrillas preformadas (PFF) del monómero, centrifugue la mezcla αS a 18 000 × g durante 15 min para separar las fibrillas del monómero.Resuspender el sedimento de fibrillas en el tampón que contiene Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0.αS PFF siempre se sonicó justo antes de sembrar.Se generaron fibrillas de αS marcadas con fluorescencia como se describió anteriormente [25].Se disolvió αS (1 mg/mL) en NaHCO3 100 mM, se sonicó durante 15 min y se centrifugó a través de un filtro de 50 kD (Amicon UFC5050) a 16 100 × g durante 15 min.Alexa Fluor 647 NHS Ester (Thermo Fisher A20006) se disolvió en DMSO a 10 mg/ml.La solución de colorante (proporción molar de colorante: αS = 2,1:1) se pipeteó en αS monomerizado durante la agitación, y la mezcla se agitó en el banco durante ~ 1 h.A continuación, la mezcla se cargó en una columna de exclusión por tamaños (Superdex 75 10/300 GL) y se eluyó con NaOH 5 mM.El pico que contenía αS ​​monomérico marcado se recogió, se dividió en alícuotas y se mantuvo congelado hasta su uso.Para los ensayos de agregación, se disolvió αS en NaOH 10 mM a 1 mg/ml.Se añadió αS-647 en una proporción de marcaje del 5 %.Luego, la solución se sonicó durante 20 min, se filtró a través de un filtro de membrana de 100 kD (Amicon Ultra, 540,655) a 16,100 xg durante 15 min a 4 °C.Las concentraciones de proteína y colorante se midieron por absorción a 280 nm y 647 nm, respectivamente, y se determinó que la relación de marcaje era del 4,9 %.Para preparar fibrillas αS marcadas, se incubaron una solución de monómero (5 % α-syn-AF647) y soluciones en NaP 100 mM, pH 7,4, NaCl 10 mM durante 120 h agregadas en una placa de 96 pocillos sin unión (Corning, n.° 3651 ) a una concentración de 30 μM con agitación intermitente en tampón de agregación (NaP 100 mM, pH 7,4, NaCl 10 mM).Se añadió una perla de vidrio de 2 mm de diámetro a cada pocillo para acelerar la agregación mediante agitación.La placa se mantuvo a 37 °C y se agitó mediante agitación orbital una vez cada 1 min durante 5 s.Se generó TDP-43 recombinante (rTDP-43) en Escherichia coli y se purificó como se describió anteriormente [21].Brevemente, rTDP-43 se unió a níquel-ácido nitrilotriacético-agarosa y se lavó con tampón de lavado 1 (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, glicerol al 10 %, sacarosa al 10 %, TCEP 1 mM), se lavó con tampón de lavado 2 (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, glicerol al 10 %, sacarosa al 10 %, imidazol grado Ultrol 50 mM, pH 8,0, TCEP 1 mM), y finalmente eluido (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, 10 % de glicerol, 10 % de sacarosa, imidazol grado Ultrol 300 mM, pH 8,0, TCEP 1 mM).Luego, rTDP-43 se ultracentrifugó en una ultracentrífuga Beckman Coulter Optima MAX-XP a 40 000 rpm durante 30 min a 4 °C para eliminar cualquier agregado preexistente.La proteína soluble se diluyó a 4 uM en el tampón de reacción (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 250 mM, glicerol al 5 %, sacarosa al 5 %, imidazol de grado Ultrol 150 mM, pH 8,0, TCEP 0,5 mM).La agregación de rTDP-43 se inició agitando a 1000 rpm a 22 °C durante 30 min con un Eppendorf ThermoMixer C. Las muestras se incubaron a 22 °C y se recolectaron después de uno a 10 días.La proteína recombinante TDP-43 de longitud completa se produce como se describió previamente [21].Para obtener el monómero TDP-43, la proteína TDP-43 se ultracentrifugó 40 000 g 30 min a 4 °C.El sobrenadante se recogió y se usó recién.Las neuronas del hipocampo WT se obtuvieron de ratones E17-18 CD-1 (Charles River).Los hipocampos se disecan en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) libre de calcio y magnesio y se disocian con tripsina-EDTA al 0,05 % a 37 °C durante 5-10 min, seguido de DNasa I al 1 % durante 2 min [26].A continuación, las células se resuspenden con medios de cultivo en placas a una concentración de 125 k/ml y se cultivan en placas o cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina.El medio se cambia a medio neurobasal (neurobasal plus + B27 + L-Glutamina 5 mM) después de 2-4 h.El cultivo se trató con Ara-C 1 mM para inhibir el crecimiento de glía en DIV3.El αS PFF se somete a ultrasonidos y se agrega directamente a la celda en DIV10.VCP y UBXD1 shRNA se entregan a través de lentivirus.Se agregaron lentivirus a las neuronas en DIV5 con MOI ≥ 1. Para los experimentos con inhibidores de LLoMe o VCP, el control de fármaco o vehículo se agregó simultáneamente con αS PFF o monómero (1 μg/mL) durante 4 h.A continuación, el medio se cambia por completo al medio neurobasal acondicionado sin fármaco y αS PFF o monómero.Las neuronas se recogieron en DIV15.Las neuronas R155H/WT se cultivaron a partir de embriones del cruce R155H/WT.El hipocampo de cada embrión se diseccionó y cultivó por separado y luego se sembró en placas a la misma densidad.Los genotipos se examinaron por PCR (Transnetyx) (Primer directo: CCTCTAATTGCACTTGTATTGCTTTGT; Primer inverso: CTGGGATCTGTCTCTACAACTTTGA).Las células se fijaron en PFA al 4 % durante 10 min y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1 % en PBS durante 10 min.Luego, las células se bloquearon con BSA al 2 % en PBS a temperatura ambiente durante 1 h.Las células se tiñeron con anticuerpo primario a 4 °C durante la noche, seguido de tres lavados con PBS.A continuación, las células se incubaron con el anticuerpo secundario marcado con Alexa 488, 555 o 647 en una dilución de 1:500 durante 1 hora a temperatura ambiente.El núcleo se tiñó con DAPI (1:1000) durante 10 min a temperatura ambiente.Después de tres lavados con PBS, las células se montan con Mowiol.Las imágenes se tomaron con un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse 80i y se procesaron a través de ImageJ.El anticuerpo se enumera en el suplemento Tabla 2.Las imágenes FRET se tomaron bajo el microscopio confocal Olympus FluoView1200.Los filtros láser y de banda se configuraron como se indica:La corteza o las células de ratón se lisan en tampón RIPA con cócteles de inhibidores de proteasa (PMSF y PIC) seguido de dos ciclos de sonicación de 30 s de encendido y 30 de apagado al 50 % de potencia.La concentración de proteína se normaliza mediante el ensayo BCA.Las muestras se cargaron en un gel del 10 al 15 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa o PVDF.Las membranas se bloquearon con leche al 5 % en PBS-Tween20 al 0,2 % y se incubaron con el anticuerpo primario en solución de bloqueo durante la noche a 4 °C.A continuación, la membrana se lavó tres veces con PBS-Tween20 al 0,2 % y se incubó con anticuerpo HRP secundario de cabra anti-conejo o ratón (1:5000) durante 1 h.La transferencia se enjuagó tres veces con PBS-Tween20 al 0,2 % y se sondó con una mezcla fresca de reactivos ECL en la oscuridad y luego se expuso con SYNGENE.Para fraccionar la porción insoluble de αS, realizamos extracción secuencial como se describe [27].Brevemente, las neuronas primero se disolvieron en TBS-1% Tx-100 y se sometieron a ultrasonidos durante diez ciclos de 30 s encendido, 30 s apagado con un 50 % de potencia.El lisado se incubaría en hielo durante 30 minutos.1/10 del lisado se guardó como proteína total, mientras que los restos se ultracentrifugaron 100.000 g 4 °C durante 30 min.El sobrenadante se recogió como fracción soluble Tx-100.El precipitado se lavó con TBS-1%Tx-100, se sonicó y se ultracentrifugó.Finalmente, el sedimento se resuspendió con TBS-SDS al 2 % y se sonicó durante 15 ciclos de 30 s encendido, 30 s apagado.Las fracciones soluble e insoluble se analizaron mediante western blot como de costumbre.La cantidad de carga se determinó por la concentración de proteína total medida por BCA.La extracción soluble e insoluble de TPD-43 se realiza como nuestro método anterior.Brevemente, las neuronas de una placa de 35 mm se lisaron primero con tampón RIPA con cócteles de inhibidores de proteasa (tampón RIPA) en hielo.A continuación, el lisado se sonicó con un sonicador QSONICA durante diez ciclos de 30 s encendido, 30 s apagado con una potencia del 50 %.1/10 del lisado se guardó como proteína total.El resto se ultracentrifugó a 100.000 g 4 °C durante 30 min.El sobrenadante se mantuvo como fracción soluble en RIPA.A continuación, el sedimento se lavó una vez con tampón RIPA, se sometió a resonancia y se ultracentrifugó con las mismas condiciones.El sedimento finalmente se resuspendió con la misma cantidad de tampón UREA (30 mm Tris, pH 8,8, 7 m urea, 2 m tiourea y 4% CHAPS) como fracción insoluble.Las fracciones soluble e insoluble se analizaron mediante western blot como de costumbre.La cantidad de carga se determinó por la concentración de proteína total medida por BCA.C57BL/6 (Núm. de stock: 000664) y VCPR155H/WT (B6;129S-Vcptm1Itl/J, Núm. de stock: 021968) se adquirieron de Jackson Laboratory.Para obtener VCP cKO (VCPR155C/FL; Rosa26-CREERT2), primero cruzamos VCP flox;flox con Rosa26-CREERT2 (B6.129-Gt (ROSA)26Sortm1(cre/ERT2)Tyj/J, Stock No: 008463) para obtener VCP flox;wt;Rosa26-CREERT2.Luego criamos esos ratones con VCPR155C/WT informado anteriormente para VCP cKO [28].Todos los ratones utilizados en el estudio y la cría tenían un fondo C57BL/6.En este estudio se utilizaron tanto ratones machos como hembras.Los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Estudios con Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington.A ambos ratones se les inyecta por vía intraperitoneal 75 mg de tamoxifeno/kg de peso corporal a las 10 semanas de edad y se espera 1 mes para la desactivación del gen.El alelo de la mutación R155C y la suficiencia de la caída del flop de VCP se confirmaron mediante PCR.La inyección intraestriacial se realiza como se describe.Se prepara αS PFF como se describe anteriormente y se diluye en PBS estéril.αS PFF se somete a ultrasonidos 10 minutos antes de la inyección.El ratón se anestesia y se inyecta en el cuerpo estriado dorsal (Bregma = 0,2 mm, línea media = 2,0 mm, profundidad = -3,2 mm) del hemisferio izquierdo.Se utiliza la misma cantidad de PBS como control del vehículo.La recuperación de los ratones se controla en la semana siguiente y se sacrifican después de 90 días.Primero se anestesió al ratón en la cámara de isofluorano y se perfundió con PBS que contenía heparina.Los cerebros completos se extrajeron del cráneo y se fijaron en PFA al 4 % durante la noche a 4 °C y se cortaron coronalmente en secciones de 40 μm y se almacenaron en solución crioprotectora a 4 °C para tinción.Las secciones primero se enjuagaron tres veces con TBS y luego se bloquearon con solución de bloqueo durante 30 min (suero de cabra normal al 5 % con Triton X-100 al 0,1 % en TBS).Las secciones se tiñeron con el anticuerpo primario en TBS-0,1 % Triton X-100 más suero de cabra normal al 2 % a 4 °C durante la noche, seguido de tres lavados con TBS.A continuación, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario marcado con Alexa 488.555 en una dilución de 1:1000 durante 2 horas a temperatura ambiente.El núcleo se tiñó con DAPI (1:1000) durante 20 min a temperatura ambiente.Después de tres lavados con TBS, las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio.True black (cat: NC1125051) se incubó con las secciones durante 5 min para extinguir la autofluorescencia.Finalmente, los portaobjetos se cubrieron con un medio de montaje Prolong Gold.Las imágenes se tomaron con un microscopio de fluorescencia Hamamatsu NanoZoomer o Nikon Eclipse 80i.Las imágenes se procesaron y la intensidad de la fluorescencia se calculó a través de ImageJ.Todos los anticuerpos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 2 complementaria.Los datos (excepto el cribado CRISPR) se analizan con GraphPad Prism 9. Las pruebas estadísticas incluyeron la prueba t no pareada, ANOVA unidireccional, prueba t múltiple, interpolación lineal (95 % de confianza) y ANOVA bidireccional.Los datos se mostraron como media ± SEM.Se utilizaron métodos de aumento de dos etapas de Benjamini Krieger y corrección de Yekutieli, Dunnett, Sidak para minimizar las falsas alarmas de las comparaciones múltiples.Para identificar los genes que regulan la siembra de αS, utilizamos una línea celular biosensora HEK293 αS CFP/YFP (biosensor αS) (Fig. 1) [4].Estas células coexpresan de manera estable dos construcciones αS.Uno etiquetado con CFP (donante) y otro con YFP (aceptor).Aplicamos exógenamente WT αS PFF humano o monómero con lipofectamina durante 24 h a la línea de biosensores αS.Solo las células tratadas con αS PFF, pero no las células tratadas con monómero o lipofectamina vacía, inducen la agregación de αS intracelular soluble, como se muestra por los agregados positivos de CFP e YFP.Este proceso dependiente de PFF se denomina actividad de siembra.Los agregados positivos de CFP/YFP se pueden visualizar mediante FRET bajo microscopía confocal (excitación = 440 nm, emisión = 500-550 nm) (Fig. 1A, panel inferior).La cuantificación del porcentaje de células FRET+ y la intensidad de FRET se pueden detectar mediante citometría de flujo (Fig. 1B) [29].La eficacia de FRET, medida como % (FRET + células) * Mediana de Intensidad Fluorescente (MFI) (FRET + células), fue significativamente mayor en el grupo tratado con αS PFF en comparación con el control de lipofectamina y los controles de monómero αS (media = 67,55 frente a 0,96 frente a .0,30) (Fig. 1C).Además, la eficiencia de FRET inducida por αS PFF es sensible y cuantitativa de una manera dependiente de la concentración (Fig. 1D).La siembra de αS puede detectarse con sensibilidad mediante FRET en la línea de biosensores αS.Imágenes representativas de microscopía confocal FRET de la línea de biosensor αS (αS CFP/YFP) tratada con lipofectamina (izquierda, ctrl), monómero αS 10 nM (centro) y αS PFF (derecha) después de 24 horas.Barra de escala = 10 μm.B Seguimiento de citometría de flujo de la señal FRET de biosensores αS.La puerta FRET+ (CFP frente a FRET) se extrajo de células vacías tratadas con lipofectamina sin agregación.C La cuantificación de la señal FRET integrada de la citometría de flujo FRET se calcula como % de células FRET+ * Mediana (intensidad FRET+).**** p < 0,0001, ns, sin significancia mediante ANOVA unidireccional.Las barras de error son ±SEM D Cuantificación de células tratadas con concentraciones crecientes de αS PFF durante 24 horas.Las células se recolectan después de 24 horas y se analizan igual que 1C.Cada punto representa un experimento independiente.Para realizar nuestra pantalla, expresamos clonalmente spCAS9 en la línea de biosensores αS y luego infectamos con una biblioteca de gRNA de Brunello que abarca 19 114 genes diferentes/4 gRNA cada uno y 1000 controles no dirigidos a un MOI bajo (< 0,3) durante 7 días con puromicina selección (Fig. 2A).El biosensor combinado de eliminación de αS-spCAS9 mantuvo la capacidad de siembra de αS de una manera dependiente de la concentración (Fig. S1).Estos biosensores se trataron con αS PFF 10 nM y se clasificaron por flujo en grupos FRET positivos y FRET negativos.El ADN se aisló de FRET positivo, FRET negativo y de la población celular total no sembrada.Luego se realizó una secuenciación profunda para identificar los ARN guía representados en cada grupo (Fig. 2A).Estos datos de secuencia se analizaron a través del algoritmo MegaCK tanto en las poblaciones positivas como negativas de FRET en comparación con el control no tratado.111 genes se enriquecieron en la población FRET positiva en comparación con la población total, y 43 genes estaban subrepresentados en el grupo FRET negativo en comparación con la población total (FDR <0.05 y cambio de pliegue> 2 o <0.5) (Fig. 2B).Estos 154 genes (puntos rojos) se consideraron "protectores" o supresores de la siembra de αS en la línea de biosensores (Fig. 2B-C; Tabla S3).La pantalla CRISPR/Cas9 de todo el genoma identifica los genes protectores de la siembra de αS.Se transdujo una línea de biosensor αS que expresaba spCAS9 de manera estable con una biblioteca lentiviral de sgRNA (Brunello).Después de la selección de antibióticos, los biosensores se sembraron con αS PFF (10 nM) y se clasificaron por flujo 24 horas más tarde.NGS recolectó y decodificó el ADN genómico de los grupos positivos y negativos, así como la población total sin clasificar.B Gráfica de volcán de genes identificados en la pantalla.En azul están todos los genes representados en el grupo FRET-, mientras que en negro están representados en el grupo FRET+.Los puntos rojos son aciertos protectores de ambos grupos (5% FDR), específicamente genes con un cambio de pliegue <0,5 que estaban subrepresentados en las células FRET- y genes >2 que estaban sobrerrepresentados en las células FRET+.C Análisis de vía de 154 genes protectores a través de g:profiler.La vía enriquecida se visualiza mediante citoscape.D FRET normalizado de biosensores αS después de la eliminación de siRNA de 9 genes identificados en la pantalla y el tratamiento con αS PFF.(n ≥9 repeticiones; *** p < 0,001, ** p < 0,01 y * p < 0,05 por ANOVA unidireccional. Las barras de error son ± SEM).E Inmunotransferencia con anti-VCP y anti-GAPDH de lisados ​​celulares de biosensores αS/células spCas9 tratadas con ARNg de VCP a una concentración baja (L), media (M) y alta (H) y recogida 6 días después de la transducción demuestra VCP a 16,5 % controles no tratados en el tratamiento de alta concentración.F FRET normalizado de biosensores αS/células spCas9 tratadas con un ARNg de VCP o ARNg de control codificado después de la aplicación de αS PFF durante 24 horas.(p = 0,0439 por una prueba t de Student de dos colas).n = 4 ensayo FRET biológicamente independiente.Los datos se presentan como media ± SEMLa pantalla identificó genes y vías previamente identificados en otras pantallas de αS para la toxicidad de αS.En particular, identificamos 15 genes asociados con el tráfico de ER-Golgi-endosoma.Estos incluyeron VPS51 y VPS52, que son componentes del complejo de proteína retrógrada asociada a Golgi (GARP).El complejo GARP interactúa con la proteína asociada a PD, LRRK2, y la eliminación de los homólogos de VPS51 o VPS52 en la levadura aumenta la acumulación y la toxicidad de αS [30].Otros modificadores no identificados previamente en las pantallas incluyen ATP6V0B, ATP6V0C y ATP6V1A que codifican subunidades de ATPasa de tipo vacuolar (V-ATPasa).ATP6V0B KD inhibe la degradación autofágica y aumenta la agregación de αS [31] y se regula a la baja en pacientes con inclusiones de αS [32].El análisis de vías identificó un enriquecimiento en genes asociados con la respuesta al estrés celular, como VCP, SEC61B y KDELR1.En particular, la respuesta al estrés del RE está regulada al alza en los cerebros con EP y se correlaciona con la toxicidad de αS en múltiples sistemas modelo [33].Validamos nueve supresores candidatos de selecciones positivas y negativas de FRET (ATP6V0C, KDELR1, LAMTOR5, RAB35, RABAC1, SEC61B, TMEM147, VCP y VPS51) mediante la eliminación de siRNA en biosensores αS.Después de 48 h de tratamiento con siRNA, se añadió αS PFF (10 nM) con lipofectamina y se midió la eficiencia de FRET 24 h más tarde.Seis supresores candidatos, cuando se derribaron, aumentaron la eficiencia de FRET e incluyeron ATP6V0C, VPS51, KDELR1, SEC61B, LAMTOR5 y VCP (Fig. 2D).Para confirmar aún más nuestros hallazgos con VCP, generamos un vector lentiviral que expresa un gRNA de control o específico de VCP, biosensores spCAS9 αS infectados durante 7 días y tratados con αS PFF.Similar a lo observado con el siRNA de VCP, la eficiencia de FRET aumentó en los biosensores VCP CRISPR KO αS (Fig. 2E-F).Como se muestra en la Fig. 1, la siembra de αS medida por FRET no se observa con la aplicación de αS monomérico [4].De acuerdo con esto, los biosensores αS tratados con ARNip de VCP no mostraron un aumento en la señal de FRET cuando se trataron con monómero αS (10 nM) en comparación con los tratados con ARNip de control (Fig. 3A).Además, la lipofectamina es necesaria para un FRET eficiente en este ensayo (sembrado de "Lipo").Transferencia de energía de resonancia de FörsterBrettschneider J, Del Tredici K, Lee VM, Trojanowski JQ.Propagación de patología en enfermedades neurodegenerativas: un enfoque en estudios humanos.J Biol Chem.Eur J Neurol.J Neuropathol Exp Neurol.J Neuropathol Exp Neurol.Ciencias.J Biol Chem.biol celular nat.Estructura.Elife.Neurología.Clin Genet.J Biol Chem.Nat Comun.J Biol Chem.Más uno.J Mol Biol.Biochem Biophys Res Comun.Más uno.Neurol frontal.Neurociencia frontal.Nat Chem Biol.J Med Chem.Célula Mol Biol.Neurona.ChemMedChem.Nervio Muscular.Neurociencias de células frontales.Ciencias.J Neurosci.Ciencias.J Biol Chem.Nat Genet.J Neurol Neurocirugía Psiquiatría.Naturaleza.Trastorno Neuromuscular.J Neurol Neurocirugía Psiquiatría.Célula.Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.Los autores declaran no tener conflictos de intereses.Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.Las imágenes u otro 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